Laboratoř molekulární diagnostiky OLG

Molekulární genetika za posledních 50 let dostala 21 Nobelových cen, letos dokonce obsadila dvě disciplíny – za medicínu a chemii. Proč? Je to náhoda? Ne. Právě teď žijeme v epoše molekulární biologie a genetiky. Genetika je královnou všech věd o živé přírodě. Veškerý život na Zemi, od bakterie, přes rostliny až po člověka, je tvořen podle stejného genetického kódu. Tento kód je uložen v DNA, přepisuje se do RNA a z ní se překládá do pořadí aminokyselin v bílkovině.

Každý z šesti miliard obyvatel Země má dědičnou informaci, čili genom, zapsánu 3,2 miliardami písmen genetického kódu. Když si uvědomíme, že se na stránku strojopisu nevejde ani dva tisíce znaků, potřebovali bychom na přepsání lidské dědičné informace  na stroji více než půldruhého milionu stránek. Na jejich hlasité přečtení by padl lidský život, a to by čtenář nesměl ani chvíli přestat číst. Jak se v takové kupě informací vůbec vyznat?…Dne 26.června roku 2000 si ve washingtonském Bílém domě před prezidentem Clintonem podali ruku genetici Craig Venter a Frank Collins. Společně ohlásili, že mezinárodní konsorcium Human Genome  Project a americká soukromá společnost Celera Genomics právě nanečisto dočetly celou lidskou dědičnou informaci. Mnohaleté úsilí, jež si vyžádalo více než 3 miliardy dolarů, bylo zdárně završeno. Prestižní vědecké časopisy Science a Nature pak v roce 2001 zveřejnily závěry výzkumu lidského genomu. Soubor všech dědičných informací je uložen v pouhých 25 000 – 35 000 genech (původní odhady se pohybovaly kolem 80 000 až 100 000). Geny, tedy ty úseky DNA, podle kterých se v našich buňkách tvoří bílkoviny, zabírají z celé dědičné informace jen o málo více než 1%. Téměř 99% lidské DNA tvoří nekódující oblasti tzv. „genetická vycpávka“, o jejímž významu máme jen nejasné tušení.  Díky perfektnímu vybavení objevují molekulární genetici stále nové geny, často však poté pátrají, čemu vůbec vlastně slouží. Čeká nás důkladná identifikace genů, jejich produktů a mutací.

Přesto už nyní je naprosto zřejmé, že molekulární genetice připadne zásadní role v dramatu lidského zdraví. V této souvislosti musím vzpomenout slova nejpozoruhodnější postavy čtení lidské genetické informace Franka Collinse. Collins je silně věřící člověk. Podle něj není náhoda, že se v Novém zákoně na mnoha místech popisuje zázračné uzdravování. Bůh dal podle Collinse tuto schopnost nejen Ježíšovi, ale i molekulárním genetikům, kteří jsou povinni využít poznatky o lidských genech v boji s chorobami. ……Bylo by velmi domýšlivé myslet si, že  stát se  dobrým molekulárním genetikem znamená být obdarován schopnostmi od Boha. Je to mnohem prostší. Znamená to velmi intenzivní a neustálé studium  nově vznikajících poznatků v molekulární biologii a  dobré indukční a dedukční myšlení. S Collinsem však musíme v jednom souhlasit: jedním z hlavních úkolů molekulární genetiky je vyřešit dosud nezdolaná úskalí medicíny. Pochopení molekulárně genetické podstaty chorob umožňuje jejich přesnou diagnostiku a v mnoha případech i cílenou léčbu.

Proto v posledních několika letech molekulárně genetické laboratoře expandují z akademické půdy do zdravotnických pracovišť, kde jsou do klinické praxe zaváděny molekulárně genetické metody.

 Nejzákladnější z nich je polymerázová řetězová reakce. V laboratořích se o ní častěji hovoří jako PCR („pí sí  ár“ -  z anglického názvu „ polymerase chain reaction“). Kery Mullis, který vynalezl tuto metodu v roce 1983, se postaral o jednu z největších revolucí v genetice a o deset let později si za ni jel do Stockholmu pro Nobelovu cenu. Genetici potřebují pro své analýzy vždy značné množství studovaného úseku DNA a Mullis našel cestu jak množit zvolený úsek DNA rychle a spolehlivě. Vyšel ze základního předpokladu, že když se od sebe oddělí vlákna dvojité šroubovice DNA, může pomocí jednotlivých stavebních kamenů – deoxynukleotidů a enzymu DNA- polymerázy zajistit, že se ke každé půlce dvojité šroubovice dotvoří její druhá část. Z jedné kopie DNA tak měl rázem dvě. Když rozplete dvě kopie DNA a nechá jim dotvořit chybějící poloviny, získá už čtyři kopie DNA. Z nich pak pořídí osm, pak šestnáct, dvaatřicet a tak dál. Po deseti cyklech bude mít přes tisíc kopií DNA, po dvaceti jich získá přes milion. Aby zajistil, že se bude ve zkumavce množit skutečně jen to, co si z celé přítomné DNA vybral, přidal Mullis do reakční směsy jakési „zarážky“ – maličké úseky DNA, tzv. primery, které přisednou na vybrané místo DNA a určí, že doplnění dvojité šroubovice bude probíhat jen mezi nimi. PCR dovoluje namnožit libovolné množství přesně vybraného úseku DNA ve vzorku, kde se tento úsek nachází byť jen v jediné kopii. Používají ji všichni, kdo s DNA pracují. Archeologové mohou prověřit úseky dědičné informace tvorů, kteří zahynuli před 50 až 100 tisíci roky. Tak byly například analyzovány úseky DNA mamutů nebo neandrtálců. Kriminalisté mohou díky PCR získat dostatek DNA pro usvědčení pachatele i z nepatrného počtu buněk (např. z kapičky krve nebo buněk ulpělých na kořínku vlasu) technikou „otisku DNA“. Identifikovat jednotlivce lze díky jedinečnosti genomu každého z nás. Otisky jsou generovány prostřednictvím souhrnu specifických opakujících se sekvencí DNA, které tvoří vzorce bez vztahu ke známým funkčním genům a které se mezi jednotlivci velmi liší, a proto odlišují jednoho člověka od druhého. Test srovnává jednotlivé otisky, aby posoudil pravděpodobnost shody mezi nimi. U testů otcovství je příbuznost dokazována stejným způsobem.

Velmi široké je klinické využití PCR diagnostiky v oblasti humánní medicíny. Má velký význam v hematologické a mikrobiologické diagnostice, což umožnilo poznání molekulární podstaty patogenů a obranných reakcí lidského organismu. PCR diagnostika hraje stále zásadnější roli v molekulárně genetické diagnostice dědičných a onkologických onemocnění. Principem molekulárně genetické diagnostiky dědičných chorob je rozpoznání a identifikace mutací v genech, které jsou v asociaci s danou chorobou. Jakmile je identifikována genetická příčina onemocnění na úrovni DNA, může se vyvinout specifický genetický test k analýze relevantních genetických charakteristik pacienta. Genetické testy mohou u individuálních pacientů stanovit nebo upřesnit diagnózu, umožňují prediktivní diagnózu, tzn. identifikaci dědičných onemocnění před jejich manifestací, prenatální a preimplantační diagnostiku odhalující závažné genetické onemocnění před narozením dítěte, výběr nejvhodnější léčby farmaky či preventivní kroky s minimalizovanými vedlejšími účinky. Ačkoliv molekulárně genetická diagnostika představuje zásadní zlepšení lékařské péče, nese určité problémy. Ty mohou zahrnovat i bolestnou zdravotní prognózu bez zaručení nápravy. Pacientovi také může způsobit závažné obtíže, pokud informace o výsledcích jeho molekulárně genetického testování padnou do nepravých rukou kvůli nedostatečnému zabezpečení údajů. Například pokud se firma o svém zaměstnanci dozví, že dotyčný má genetické dispozice k závažné dědičné chorobě s pozdním nástupem jako je například Huntingtonova choroba, pak člověka s takovýmto genetickým „cejchem“ asi těžko pověří významnou funkcí. Proto musí být pečlivě ošetřena bezpečnost genetických údajů a etické otázky. Právo nevědět musí být zachováno a genetické údaje o pacientovi a jeho příbuzných musí být chráněny. Dalším problémem jsou vysoké náklady na molekulárně genetická vyšetření a to jak po stránce používaných chemikálií, tak především přístrojové techniky.

 V poslední době došlo díky významným objevům v oblasti molekulární biologie k prudkému rozvoji celé řady nových moderních technik, které podstatně zvýšily citlivost a přesnost molekulárně genetických testů. V naší molekulárně diagnostické  laboratoři   od jejího založení sledujeme  a  snažíme se zavádět nové diagnostické trendy v oblasti molekulární diagnostiky monogenně dědičných chorob, tedy takových, které jsou způsobeny mutacemi v jednotlivých genech, a nádorových onemocnění. Od počátku je zde široce využívána PCR. Základní postup při detekci mutací je amplifikace kódujících oblastí sledovaného genu a jejich následná analýza, ke které je používáno široké spektrum metod: od metod přímé detekce určitých mutací přes vyhledávací metody, které umožňují „prohledat“ sledovaný úsek DNA a určit zda v něm je nebo není nějaká odchylka od standardní sekvence, až po sekvenční analýzu, kdy je přesně stanovena sekvence DNA a je možné jasně identifikovat pozici a typ mutace. 

 V počátcích existence naší laboratoře jsme používali pro analýzu genů základní molekulárně biologické postupy podle toho, jak nám to dovolilo vybavení laboratoře. Tvořilo jej několik PCR amplifikátorů, centrifugy, elektroforetické aparatury…..Postupem doby do naší přístrojové rodiny přibývali za naší velké radosti stále noví členové, kteří nám pomáhali dělat modernější, efektivnější a citlivější analýzy. Významnou událost pro nás a značný pokrok pro naši laboratoř znamenalo pořízení genetického analyzátoru. Díky němu jsme do našeho „repertoáru“ metod mohli  zařadit fragmentační analýzu a sekvenaci, metody, bez nichž si dnes solidní molekulární diagnostiku již nedovedeme představit. Využíváme je tak intenzivně, že náš analyzátor pracuje ve dne v noci, takřka nonstop. Nyní se už moc těšíme na jeho modernějšího a efektivnějšího kolegu, který nám dovolí zvládat mnohem více práce v kratším čase. Pokud mluvím o přístrojích, nemůžu nezmínit Real-Time PCR. Je to náš velký oblíbenec, protože díky němu jsme mohli zavést nové modifikace PCR. Velmi elegantní je analýza teploty tání hybridizačních sond  pro vysokofrekvenční PCR, což je metoda vhodná pro citlivou, přesnou a rychlou detekci mutací ve sledovaných genech. Další aplikací je PCR v reálném čase (real-time PCR), která umožňuje monitorovat množství produktu PCR během celé reakce, na rozdíl od základního typu PCR, kdy je množství produktu vyhodnocena až po jejím ukončení. Metoda real-time PCR má široké uplatnění v diagnostice nádorových onemocnění. Používá se při včasné detekci nádorových buněk, monitorování onemocnění v průběhu terapie a detekci minimální zbytkové choroby. Pořízení přístroje pro real-time PCR metodu  nám tedy otevřelo možnost rozšířit náš program -  diagnostiku monogenně dědičných chorob o diagnostiku onkologických onemocnění. Vybavení laboratoře molekulární diagnostiky je z mého pohledu na velmi dobré úrovni a podle současných trendů. Je velmi příjemné procházet jednotlivé místnosti našeho pracoviště, kterým vévodí krásné, moderní přístroje. Je velmi motivující učit se s nimi pracovat a zavádět pomocí nich nové metody. Díky nim můžeme provádět molekulárně genetické vyšetření širokého spektra chorob a zavádět diagnostiku nových dědičných onemocnění podle požadavků klinických lékařů.

 Vyjmenovávat všechny choroby, které vyšetřujeme na úrovni DNA, by bylo velmi zdlouhavé a jejich seznam je uveden na našich webových stránkách. Je však důležité zmínit, že molekulárně genetickou diagnostikou některých chorob se zabýváme jako jediní v České republice a  molekulární vyšetření některých dědičných onemocnění po nás žádají lékaři i z okolních států, platí to  například pro neurofibromatózu typu I a II, maligní hypertermii a syndrom dlouhého QT intervalu. To je pro nás velmi zavazující. Neznamená to však, že bychom diagnostikám, kterými se u nás zabývají i jiná pracoviště v ČR, věnovali méně pozornosti. Snažíme se je provádět na solidní úrovni a v souladu s nejnovějšími poznatky. Jde o diagnostiky chorob, které se v populaci vyskytují častěji, například cystická fibróza, a proto je vyšetřováno mnoho pro ně suspektních pacientů. Musíme tedy používat velmi efektivní strategie vyšetření, abychom zanalyzovali co nejpřesněji, co nejrychleji a co nejvíce pacientů.

 Naší velkou snahou je udržet dobrou odbornou úroveň naší práce. Z tohoto důvodu zavádíme stále nové metody  podle aktuálních vědeckých prací světových autorů.  Sami se pokoušíme také vyvíjet analýzy námi sledovaných genů a modifikovat publikované metody podle našich potřeb. Díky tomuto přístupu a velmi solidnímu přístrojovému vybavení získáváme analýzou DNA množství informací. Je však velmi důležité umět pochopit jejich význam a využít jich ve prospěch pacientů. Efekt hrdla láhve – přetlak informací na úrovni DNA a na druhé straně stokrát pomalejší pochopení smyslu těchto informací, se kterým se  musí vypořádat  obecně  dnešní molekulární genetika, se projevuje ve zmenšené míře i při hodnocení výsledků analýz v naší laboratoři. Například dokážeme odhalit stále více změn v sekvenci DNA jednotlivých genů, dokonce takové, které ještě nebyly popsány v odborné literatuře jinými autory. Ne vždy jsme však schopni rozhodnout, zda tato odchylka od standardu je zodpovědná za onemocnění nebo je to pouze jiná varianta genu bez vlivu na funkci proteinu, který tento gen kóduje tzn. bez vlivu na jeho projev v organismu.

 V naší laboratoři se snažíme zachytit nové diagnostické trendy molekulární genetiky. Povedlo se nám postupně zavést všechny metody, které jsou potřebné pro analýzu námi studovaných genů, poté je stabilizovat v rutinní diagnostice, abychom se vzápětí mohli začít rozhlížet po nových moderních technikách využitelných při vyšetřování našich pacientů. Molekulární diagnostika je obor velmi specifický, kde jak rutinní diagnostická, tak výzkumná práce je založena  na velmi důkladných analýzách a  vyžaduje  plné soustředění, pečlivost, trpělivost a hodiny strávené v laboratoři nebo studiem odborné literatury.

 Vyřešení jakéhokoliv úkolu a každý sebemenší úspěch je založen na týmové spolupráci. Je velmi motivující sledovat pracovníky naší laboratoře v průběhu pracovního dne, s jakým zápalem a energií pracují. Čtyři laborantky a pět vysokoškolaček vzdělaných v oborech molekulární biologie, genetiky a chemie pracuje jako homogenní tým, kdy se jeho jednotliví členové vzájemně doplňují, vzájemně si ocení práci, ale dokážou se i navzájem upozornit na nedostatky a omyly. Úkolem vysokoškoláků je udávat podle poznatků získaných v literatuře a na odborných konferencích směr, kterým by se měla diagnostika v naší laboratoři ubírat, zavádět nové techniky a uvést je do rutinní praxe. Laborantky pak udržují bezproblémový chod laboratoře a na jejich bedrech leží provádění již zavedených analýz, které pak zhodnotí vysokoškolák společně s vytvořením zprávy o výsledku vyšetření. Všechny nás spojuje společný zájem – dobře a bezchybně vyšetření pacienti podle nejnovějších trendů molekulární diagnostiky. A ještě něco. Všechny nás velmi baví naše práce. Baví nás genetika a uvědomujeme si, že sice zpovzdálí ale přece sledujeme něco velmi zajímavého.

Genetika prožívá svůj zlatý věk a je štěstí být u toho.

 

Nemocniční listy, ročník VII., číslo 4 – prosinec 2006

RNDr. Iveta Valášková